Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

Существует целый ряд методов диагностики различных заболеваний, однако диагностика методом ПЦР зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. Методом ПЦР занимаются уже более 30 лет, и за это время он значительно эволюционировал.

Основой метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. Этому способствуют ферменты и изменения температуры (от 50 до 95°С). В результате процесса, называемого амплификацией, из одной молекулы ДНК возбудителя в биологической пробе пациента образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Процесс образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и после тридцати-сорока циклов новых молекул становится достаточно для проведения подробного анализа методом электрофореза.

В дополнение к простой амплификации фрагментов ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Из-за этих возможностей ПЦР может использоваться не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Процедура ПЦР-диагностики проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. Сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов РНК. В некоторых модификациях можно использовать режим амплификации при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Этот метод не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет использовать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше повышает точность использования ПЦР-диагностики.

Метод ПЦР-диагностики в клинической медицине широко используется во многих областях, включая урогинекологию, неонатологию, службу крови, клинику инфекционных заболеваний, фтизиатрию и пульмонологию.

В урогинекологии, где инфекционные заболевания могут вызвать бесплодие и невынашивание беременности у женщин, метод ПЦР позволяет выявить целый "букет" половых инфекций, включая хламидиоз, микоплазму, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Выявление этих инфекций своевременно помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин. Также метод ПЦР используется для выявления вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, в особенности вирус Герпеса и вирус папилломы человека.

В неонатологии метод ПЦР-диагностики позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.

В службе крови метод ПЦР-диагностики применяется для избежания риска переливания пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты. Этот метод превосходит по точности серологические методы, так как он способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

Клиника инфекционных заболеваний также использует метод ПЦР-диагностики. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия и токсоплазмоз.

В фтизиатрии и пульмонологии метод ПЦР-диагностики позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Кроме того, с помощью этого метода можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР также используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Заметим, что метод ПЦР-диагностики широко используется не только в клинической медицине, но и в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що Полімеразна Ланцюгова Реакція (ПЦР) є відносно "молодим" методом, ключове місце в медичній практиці вона займає завдяки очевидним перевагам порівняно з іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, і тому лише опосередковано вказують на присутність мікроорганізмів. Наявність специфічного участка в ДНК, виявленого за допомогою ПЦР, безпомилково або майже безпомилково вказує на присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, який характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність виключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як в імунологічних методах досліджень помилки досить ймовірні через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. Завдяки ПЦР-діагностиці можна виявити присутність навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в організмі в тих випадках, коли звичайними методами це практично неможливо зробити. ПЦР визначає наявність всього 10-100 клітин у зразку, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна визначити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103-105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість застосовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностуючи єдиновременно кілька збудників із одного біологічного зразка.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та виділення культури збудника, то і багато часу на це не потрібно. Весь цикл - від забору біоматеріалу до отримання результатів - займає 4-5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складні форми мікроорганізмів, які зустрічаються в тих випадках, коли захворювання перебігає у прихованій формі.

Методом ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але й у грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР имеет несколько этапов, которые проводятся в специальной лаборатории.

Первым этапом является забор биоматериала. Эта процедура проводится с помощью стерильного оборудования и только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть различные эпителиальные соскобы, моча, мокрота, кровь, сыворотка, плазма, биологические жидкости, а также биоптаты. Запрещено попадание следов крови в материал.

Следующий этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы можно хранить на комнатной температуре в течение не более 2 часов или в холодильнике на температуре 2-8°С не более 1 суток. Некоторые биоматериалы допускают замораживание на срок до 2 недель, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Если требуется транспортировка, то пробы следует помещать в специальные термоконтейнеры или термосы.

Далее производится выделение ДНК из образца методом твердофазной сорбции. Затем в микроцентрифугу добавляется амплификационная смесь, после чего пробы устанавливаются в программируемый термостат и проводится амплификация. Время проведения зависит от заданной программы и составляет 2-3 часа.

После амплификации проводится регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяется методом электрофореза и образуется светящаяся полоса при облучении ультрафиолетовым излучением. Наличие светящейся полосы в ультрафиолетовом свете свидетельствует о положительном результате.

Интерпретация результатов исследования позволяет сделать выводы о наличии или отсутствии инфекции в организме человека. Количественный результат ПЦР-анализа может помочь врачу определить степень активности заболевания и выбрать соответствующее лечение.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com